A la recherche de matière noire microbienne

« A la recherche de matière noire microbienne », source Nature du 8 juin 2020.

Des chercheurs développent des technologies pour trouver et développer des microbes que les biologistes ont eu du mal à cultiver en laboratoire.

Chaque chercheur qui entre dans le laboratoire de Yoichi Kamagata dans l'espoir de développer des micro-organismes intéressants subit une initiation: il essaie de cultiver Oscillospira guilliermondii, une bactérie retrouvée dans l'intestin de vaches et de moutons, mais jamais cultivée en laboratoire. Kamagata, microbiologiste à l'Institut national des sciences et technologies industrielles avancées de Tsukuba, au Japon, est fasciné par les microbes en forme de bâtonnets - dix fois ou plus la taille du célèbre habitant de l'intestin, Escherichia coli - depuis plus d'une décennie, car il semble prospérer uniquement chez des animaux qui se régalent d'herbe fraîche.

« Jusqu'à présent, personne n'a réussi », déplore Masaru Nobu, ingénieur et microbiologiste dans le groupe de Kamagata.

Oscillospira guilliermondii n'est guère unique; la grande majorité de la diversité microbienne reste non cultivable. Cette «matière noire» microbienne pourrait contenir des enzymes utiles, de nouveaux antimicrobiens et d’autres thérapies. La métagénomique moderne, qui implique le séquençage de l'ADN de tous les microbes dans une communauté à la fois, a révélé la composition microbienne de divers environnements, mais elle ne permet pas aux chercheurs de répondre à des questions fondamentales sur les microbes, telles que ce qu'ils mangent? Quels métabolites produisent-ils? Et comment interagissent-ils avec les autres dans leur environnement? Pour trouver les réponses, les microbiologistes doivent d'abord isoler, puis cultiver, les micro-organismes en laboratoire.

Cela peut être une affaire délicate. Certains microbes se développent très lentement, ont des besoins capricieux ou ne peuvent se développer qu'en présence de certains autres microbes. Quelques scientifiques adoptent une approche non ciblée, établissant des cultures avec l'idée que tout ce qui pousse a de bonnes chances d'être intéressant; d'autres ciblent des microbes spécifiques qu'ils souhaitent mieux comprendre. Quelle que soit l'approche, cultiver quelque chose que personne n'a cultivé auparavant nécessite de la persévérance, de la patience et de la chance.

« C'est une illusion de croire que l'on peut travailler sur des micro-organismes sans les faire croître », explique Didier Raoult, directeur de l'Institut Méditerranéen Infection du CHU de Marseille, France. Son aventure a commencé quand il était «jeune», dit-il, en 1983, quand, malgré leur réputation d'être l'une des bactéries les plus difficiles à isoler et à cultiver, il a décidé d'étudier les rickettsies. Ses étudiants possèdent le même esprit; certains sont allés jusqu'à déféquer en laboratoire, afin de pouvoir rapidement placer les échantillons dans des conditions sans oxygène qui hébergent des microbes intéressants. Leur dévouement a révélé au moins une nouvelle espèce, Faecalibacterium timonensis, et a permis la culture de plusieurs autres, ouvrant une série de microbes sensibles à l'oxygène à l'examen en laboratoire.

Parti à la pêche

Dans ses chasses plus conventionnelles, en utilisant des échantillons de patients ou d'autres volontaires, Raoult jette un large filet. Sa méthode, appelée culturomique, intègre la manipulation robotique des liquides pour créer diverses conditions de culture, ainsi que la spectrométrie de masse et le séquençage de l'ARN ribosomal pour identifier ce qui pousse. Raoult estime qu'il a jusqu'à présent produit environ 700 nouveaux micro-organismes, principalement de l'intestin humain.

En effet, l'un des plus grands défis de son laboratoire, dit Raoult, est de suivre le nom et la description des nouvelles espèces. L’équipe choisit souvent des noms qui honorent d’autres chercheurs, reflètent la maladie de la personne qui a donné l’échantillon de selles ou mettent en évidence l’emplacement de l’institut. Les rapports récents, par exemple, incluent une bactérie en forme de bâtonnet (Gordonibacter massiliensis) que le groupe a nommé d'après Massilia, l'ancien nom de Marseille et Prevotella marseillensis, d'une personne vivant à Marseille avec une infection à Clostridium difficile.

Les microbes trompeurs qui secouent l'arbre de vie

Des chercheurs tels que Raoult tentent de trouver au laboratoire des conditions pouvant accueillir de nouveaux microbes, souvent en copiant des environnements naturels. Mais Slava Epstein, microbiologiste à la Northeastern University de Boston, Massachusetts, va encore plus loin. « Pourquoi imitons-nous? » il dit. « Cultivons simplement des organismes dans la nature. »

L'équipe d'Epstein a conçu plusieurs appareils qui permettent aux chercheurs d'incuber des cultures pures dans des sols naturels ou des sédiments. Une version peu coûteuse est la puce d'isolement, ou ichip, qui est construite à partir d'un support de pointe de micropipette. Des chercheurs remplissent les trous avec un échantillon microbien dilué dans de la gélose fondue, dans l'espoir que chaque chambre contiendra un ou quelques microbes de starter. Les membranes semi-perméables en polycarbonate de chaque côté du rack permettent aux nutriments et autres molécules de pénétrer dans les chambres depuis l'environnement, mais empêchent les autres microbes d'y pénétrer.

Souvent, l'équipe rassemble simplement un seau de terre et le conserve dans le laboratoire, en glissant dans des ichips pour que les chercheurs puissent développer leurs cultures. Ils laissent également occasionnellement des ichips dans l'environnement naturel, mais cela peut entraîner des interférences avec les chiens et la faune. « Les choses que nous détestons le plus sont les crabes », dit Epstein, « car ils viennent parfois et, avec leurs pines perforer nos membranes. »

En 2016, Brittany Berdy, alors étudiante diplômée d'Epstein, a fait un tour en avion militaire vers la base aérienne de Thulé, sur la côte nord-ouest du Groenland, pour rechercher des communautés microbiennes avec des adaptations uniques à l'environnement extrême. « Nous étions si loin au nord, qu'on a du aller vers le sud pour voir les aurores boréales », se souvient Berdy, désormais au Broad Institute of MIT et à Harvard à Cambridge, Massachusetts. Elle a pataugé dans les eaux froides d'un lac voisin sans nom pour placer les ichips, et est revenue quelques semaines plus tard pour les récupérer.

De retour à Boston, Berdy a essayé d'imiter les conditions du lac avec différents types de milieux à différentes dilutions. La partie la plus délicate correspondait à la température du lac à 10°C, trop froide pour un bain-marie, trop chaude pour une chambre froide. L'équipe a finalement réussi à utiliser un réfrigérateur sur le réglage le plus chaud, la porte légèrement entrouverte.

Système de jumelage

Des chercheurs comme Berdy, Epstein et Raoult ne savent pas exactement ce qu’ils vont retirer de leur culture. Mais souvent, des chercheurs recherchent quelque chose de spécifique. Par exemple, Mircea Podar, microbiologiste au Oak Ridge National Laboratory dans le Tennessee, s'intéresse aux grandes et diverses Saccharibacteria (anciennement TM7), qui font partie de la communauté des microbes qui vivent dans la bouche humaine, mais qui ne sont pas cultivées en laboratoire jusque récemment.

En 1996, les Saccharibacteria ont été parmi les premiers phylums à être identifiés par séquençage seul, plutôt qu'à partir d'une culture, dans un échantillon provenant d'une tourbière. Bien que n'étant pas particulièrement abondant dans le microbiome oral, leurs populations augmentent et diminuent avec certaines maladies - dont la parodontie - suggérant que les bactéries ont un rôle dans la santé. On les trouve également dans l'intestin humain, ainsi que dans la bouche des chiens, des chats et des dauphins, ainsi que dans les sols, les sédiments et les eaux usées. «Ils sont un peu partout», explique Podar.

Au début des années 2010, Podar a conçu un plan pour isoler les Saccharibacteria: utiliser le génome du microbe, qui est connu du séquençage unicellulaire, pour prédire quelles protéines se trouvent à la surface des cellules, puis générer des anticorps contre des versions artificielles de ces protéines. Les chercheurs pourraient utiliser des versions marquées par fluorescence de ces anticorps pour étiqueter les micro-organismes et les isoler d'un échantillon de salive en utilisant la cytométrie en flux.

Le premier postdoctorant du projet, James Campbell, a utilisé cette approche pour obtenir plusieurs cultures contenant des Saccharibacteria. Mais ce n'est que des années plus tard, après que Karissa Cross, étudiante diplômée, a repris le projet en 2014, que l'équipe a réussi.

« C'était tellement difficile, et il y avait de nombreux cas où je me sentais comme si cela n'allait jamais se produire », se souvient Cross, maintenant postdoctorant à l'Université Vanderbilt de Nashville, au Tennessee. Elle a essayé la culture liquide, la culture solide et la gélose au chocolat, à base de globules rouges lysés, entre autres recettes. « Il a fallu des jours pour créer des milieux. » Rien n'a marché.

Puis, en 2015, d'autres chercheurs ont signalé un indice crucial: les Saccharibacteria ne peuvent pas vivre seules. Ces minuscules bactéries sphériques, de seulement 200 à 300 nanomètres de diamètre, nécessitent un hôte du phylum Actinobacteria. En essayant d’isoler les Saccharibacteria, le groupe de Podar avait par inadvertance omis un partenaire clé.

Enfin, à l'été 2018, Cross a obtenu des séquences ADN correspondant aux Saccharibacteria de l'une de ses co-cultures - et pas seulement de n'importe quelle Saccharibacteria, mais probablement d'une nouvelle famille ou d'un nouvel ordre. Ce fut son moment eureka le plus important de ses études supérieures, dit-elle. Elle a envoyé un courriel à Podar, « Je pense que nous l'avons eu », et quelques secondes plus tard, elle a entendu ses pas descendre le couloir. Ils ont topé leurs mains.

La bonne recette

Quand il s'agit de nourrir de tels microbes difficiles, les détails comptent. Et un buffet à volonté d'acides aminés et de sucres, tels que ceux que l'on trouve dans les formulations de milieux standardisés, n'est pas nécessairement la bonne approche, explique Jörg Overmann, microbiologiste et directeur scientifique du Leibniz Institute DSMZ-German Culture Collection of Microorganisms and Cell Cultures à Braunschweig. La baisse de la concentration en nutriments retarde la croissance des microbes à croissance rapide, donnant aux producteurs lents le temps de se répliquer.

Les substrats de croissance physique sont également importants. L’équipe d’Overmann fait parfois pendre un morceau de surface solide - de l’acier ou du verre, par exemple - dans une culture liquide pour fournir un substrat aux biofilms. « Nous obtenons des produits entièrement nouveaux qui sont entièrement différents de ce que vous obtenez sur une milieu gélosé », dit-il. Dans une étude utilisant cette technique avec des échantillons d'eau douce et de sol, l'équipe a dénombré plus d'une douzaine de types de bactéries jamais cultivées, dont au moins cinq nouveaux genres.

L'équipe de Kamagata utilise des bioréacteurs pour maintenir un flux de nutriments et éliminer les déchets. Garder la concentration globale de nutriments à un niveau plus bas reflète mieux l'habitat marin des organismes cibles, dit-il. Les chercheurs et leurs collaborateurs ont suspendu une éponge en polyuréthane (comme une éponge de cuisine) dans un réacteur pour mettre en culture, pour la première fois, une archéon d'eau profonde du clade de type eucaryote connu sous le nom d'Asgard archaea.

Pour savoir où commencer, les chercheurs peuvent consulter la base de données BacDive, qui répertorie les caractéristiques et les conditions de culture de plus de 80 000 souches cultivées provenant de 34 phylums bactériens et 3 phyliques archéens. Les informations génomiques, lorsqu'elles sont disponibles, peuvent également fournir des indices, explique Christian Jogler, microbiologiste à l'Université Friedrich Schiller d'Iéna, Allemagne.

Mais même les préoccupations des piétons peuvent faire une différence, prévient Jogler. Plutôt que de compter sur des systèmes de purification d'eau ultra pure, tels que Milli-Q, que de nombreux laboratoires utilisent, le groupe Jogler fabrique sa propre eau pure en la distillant deux fois. L'eau Milli-Q peut contenir des produits chimiques qui bloquent la croissance de certaines cultures, dit-il. De plus, ajoute Jogler, la gélose couramment utilisée comme agent gélifiant peut inhiber la croissance, il essaie donc parfois des alternatives telles que la gomme gellane.

Hub NatureTech

Même la façon dont la gélose est préparée peut être importante, a découvert le groupe de Kamagata. Lorsque la gélose est stérilisée à la chaleur avec des phosphates, elle produit du peroxyde d'hydrogène qui empêche certains microbes de se développer. L'autoclavage des composants séparément élimine le problème et a permis à l'équipe de cultiver des microbes auparavant non cultivés.

La patience est la clé. Il a fallu plus de 12 ans à Kamagata et à ses collègues pour développer leur archéon, baptisé provisoirement 'Prometheoarchaeum syntrophicum'. Mais une fois que les microbiologistes obtiennent la première culture d'un nouvel organisme, ce microbe se développe généralement plus rapidement.

Epstein appelle le processus domestication. Il suggère qu'au cours du premier cycle de croissance lent, certains microbes modifient leur épigénome; les marqueurs moléculaires sur l'ADN qui contrôlent l'expression des gènes, pour s'adapter aux conditions de laboratoire. Ensuite, ils grandissent plus vite.

Terre et ciel

Maintenant, Epstein développe une technologie pour isoler et cultiver de nouveaux microbes entièrement in situ.

Il appelle le dispositif Gulliver, en l'honneur de l'aventurier dans le livre de Jonathan Swift, 1726, les voyages de Gulliver. Les gullivers sont de petites boîtes remplies de gel stérile, avec une surface à membrane semi-perméable, comme celle de l'ichip, pour permettre aux nutriments et aux signaux de se diffuser. Un seul pore, d'un micromètre de diamètre, permet à un microbe individuel d'entrer de l'environnement. Ce microbe devrait boucher l'entrée, mais ses descendants pourraient peupler le gel à l'intérieur de la boîte, formant une colonie.

Finalement, dit Epstein, il pourrait être possible d'obtenir des résultats d'un gulliver sans l'ouvrir, ni même le récupérer. Les nanocapteurs pourraient collecter et renvoyer des données sur les niveaux d'oxygène ou de dioxyde de carbone, ou sur la production de composés de signalisation ou d'antibiotiques, imagine-t-il. Après avoir laissé tomber l'appareil, disons, dans les profondeurs de l'océan Arctique, les chercheurs pourraient simplement partir en vacances et attendez que les résultats affluent, plaisante-t-il.

Dans les mois à venir, Epstein prévoit de tester des gullivers au mont Erebus, un volcan antarctique actif. Mais son objectif ultime est au-delà de la Terre, déployant les appareils sur des corps potentiellement hébergeurs de vie tels que Mars ou la lune de Jupiter, Europe.

Le temps dira si des microbes existent dans de tels endroits. En attendant, il y a beaucoup de diversité microbienne sur la Terre pour occuper les chercheurs. Avec les bonnes techniques, dit Raoult, il devrait être possible de domestiquer et d'étudier tout micro-organisme, à terme.

«Non cultivable», estime-t-il, « est une insulte au futur. »