Des
chercheurs développent des technologies pour trouver et développer
des microbes que les biologistes ont eu du mal à cultiver en
laboratoire.
Chaque
chercheur qui entre dans le laboratoire de Yoichi Kamagata dans
l'espoir de développer des micro-organismes intéressants subit une
initiation: il essaie de cultiver Oscillospira guilliermondii,
une bactérie retrouvée dans l'intestin de vaches et de moutons,
mais jamais cultivée en laboratoire. Kamagata, microbiologiste à
l'Institut national des sciences et technologies industrielles
avancées de Tsukuba, au Japon, est fasciné par les microbes en
forme de bâtonnets - dix fois ou plus la taille du célèbre
habitant de l'intestin, Escherichia coli - depuis plus d'une
décennie, car il semble prospérer uniquement chez des animaux qui
se régalent d'herbe fraîche.
« Jusqu'à
présent, personne n'a réussi », déplore Masaru Nobu,
ingénieur et microbiologiste dans le groupe de Kamagata.
Oscillospira
guilliermondii n'est guère unique; la grande majorité de la
diversité microbienne reste non cultivable. Cette «matière noire»
microbienne pourrait contenir des enzymes utiles, de nouveaux
antimicrobiens et d’autres thérapies. La métagénomique moderne,
qui implique le séquençage de l'ADN de tous les microbes dans une
communauté à la fois, a révélé la composition microbienne de
divers environnements, mais elle ne permet pas aux chercheurs de
répondre à des questions fondamentales sur les microbes, telles que
ce qu'ils mangent? Quels métabolites produisent-ils? Et comment
interagissent-ils avec les autres dans leur environnement? Pour
trouver les réponses, les microbiologistes doivent d'abord isoler,
puis cultiver, les micro-organismes en laboratoire.
Cela
peut être une affaire délicate. Certains microbes se développent
très lentement, ont des besoins capricieux ou ne peuvent se
développer qu'en présence de certains autres microbes. Quelques
scientifiques adoptent une approche non ciblée, établissant des
cultures avec l'idée que tout ce qui pousse a de bonnes chances
d'être intéressant; d'autres ciblent des microbes spécifiques
qu'ils souhaitent mieux comprendre. Quelle que soit l'approche,
cultiver quelque chose que personne n'a cultivé auparavant nécessite
de la persévérance, de la patience et de la chance.
« C'est
une illusion de croire que l'on peut travailler sur des
micro-organismes sans les faire croître », explique Didier
Raoult, directeur de l'Institut Méditerranéen Infection du CHU
de Marseille, France. Son aventure a commencé quand il était
«jeune», dit-il, en 1983, quand, malgré leur réputation d'être
l'une des bactéries les plus difficiles à isoler et à cultiver, il
a décidé d'étudier les rickettsies. Ses étudiants possèdent le
même esprit; certains sont allés jusqu'à déféquer en
laboratoire, afin de pouvoir rapidement placer les échantillons dans
des conditions sans oxygène qui hébergent des microbes
intéressants. Leur dévouement a révélé au moins une nouvelle
espèce, Faecalibacterium timonensis, et a permis la culture
de plusieurs autres, ouvrant une série de microbes sensibles à
l'oxygène à l'examen en laboratoire.
Parti
à la pêche
Dans
ses chasses plus conventionnelles, en utilisant des échantillons de
patients ou d'autres volontaires, Raoult jette un large filet. Sa
méthode, appelée culturomique,
intègre la manipulation robotique des liquides pour créer diverses
conditions de culture, ainsi que la spectrométrie de masse et le
séquençage de l'ARN ribosomal pour identifier ce qui pousse. Raoult
estime qu'il a jusqu'à présent produit environ 700 nouveaux
micro-organismes, principalement de l'intestin humain.
En
effet, l'un des plus grands défis de son laboratoire, dit Raoult,
est de suivre le nom et la description des nouvelles espèces.
L’équipe choisit souvent des noms qui honorent d’autres
chercheurs, reflètent la maladie de la personne qui a donné
l’échantillon de selles ou mettent en évidence l’emplacement de
l’institut. Les rapports récents, par exemple, incluent une
bactérie en forme de bâtonnet (Gordonibacter
massiliensis) que le groupe a nommé d'après Massilia,
l'ancien nom de Marseille et Prevotella
marseillensis, d'une personne vivant à Marseille avec une
infection à Clostridium difficile.
Les
microbes trompeurs qui secouent l'arbre de vie
Des
chercheurs tels que Raoult tentent de trouver au laboratoire des
conditions pouvant accueillir de nouveaux microbes, souvent en
copiant des environnements naturels. Mais Slava Epstein,
microbiologiste à la Northeastern University de Boston,
Massachusetts, va encore plus loin. « Pourquoi
imitons-nous? » il dit. « Cultivons simplement des
organismes dans la nature. »
L'équipe
d'Epstein a conçu plusieurs appareils qui permettent aux
chercheurs d'incuber des cultures pures dans des sols naturels ou des
sédiments. Une version peu coûteuse est la puce d'isolement, ou
ichip, qui est construite à partir d'un support de pointe de
micropipette. Des chercheurs remplissent les trous avec un
échantillon microbien dilué dans de la gélose fondue, dans
l'espoir que chaque chambre contiendra un ou quelques microbes de
starter. Les membranes semi-perméables en polycarbonate de chaque
côté du rack permettent aux nutriments et autres molécules de
pénétrer dans les chambres depuis l'environnement, mais empêchent
les autres microbes d'y pénétrer.
Souvent,
l'équipe rassemble simplement un seau de terre et le conserve dans
le laboratoire, en glissant dans des ichips pour que les chercheurs
puissent développer leurs cultures. Ils laissent également
occasionnellement des ichips dans l'environnement naturel, mais cela
peut entraîner des interférences avec les chiens et la faune. « Les
choses que nous détestons le plus sont les crabes », dit
Epstein, « car ils viennent parfois et, avec leurs pines
perforer nos membranes. »
En
2016, Brittany Berdy, alors étudiante diplômée d'Epstein, a fait
un tour en avion militaire vers la base aérienne de Thulé, sur la
côte nord-ouest du Groenland, pour rechercher des communautés
microbiennes avec des adaptations uniques à l'environnement extrême.
« Nous étions si loin au nord, qu'on a du
aller vers le sud pour voir les aurores boréales »,
se souvient Berdy, désormais au Broad Institute of MIT et à Harvard
à Cambridge, Massachusetts. Elle a pataugé dans les eaux froides
d'un lac voisin sans nom pour placer les ichips, et est revenue
quelques semaines plus tard pour les récupérer.
De
retour à Boston, Berdy a essayé d'imiter les conditions du lac avec
différents types de milieux à différentes dilutions. La partie la
plus délicate correspondait à la température du lac à 10°C, trop
froide pour un bain-marie, trop chaude pour une chambre froide.
L'équipe a finalement réussi à utiliser un réfrigérateur sur le
réglage le plus chaud, la porte légèrement entrouverte.
Système
de jumelage
Des
chercheurs comme Berdy, Epstein et Raoult ne savent pas exactement ce
qu’ils vont retirer de leur culture. Mais souvent, des chercheurs
recherchent quelque chose de spécifique. Par exemple, Mircea Podar,
microbiologiste au Oak Ridge National Laboratory dans le Tennessee,
s'intéresse aux grandes et diverses Saccharibacteria
(anciennement TM7), qui font partie de la communauté des microbes
qui vivent dans la bouche humaine, mais qui ne sont pas cultivées en
laboratoire jusque récemment.
En
1996, les Saccharibacteria
ont été parmi les premiers phylums à être identifiés par
séquençage seul, plutôt qu'à partir d'une culture, dans un
échantillon provenant d'une tourbière. Bien que n'étant pas
particulièrement abondant dans le microbiome oral, leurs populations
augmentent et diminuent avec certaines maladies - dont la parodontie
- suggérant que les bactéries ont un rôle dans la santé. On les
trouve également dans l'intestin humain, ainsi que dans la bouche
des chiens, des chats et des dauphins, ainsi que dans les sols, les
sédiments et les eaux usées. «Ils sont un peu partout»,
explique Podar.
Au
début des années 2010, Podar a conçu un plan pour isoler les
Saccharibacteria: utiliser le génome du microbe, qui est
connu du séquençage unicellulaire, pour prédire quelles protéines
se trouvent à la surface des cellules, puis générer des anticorps
contre des versions artificielles de ces protéines. Les chercheurs
pourraient utiliser des versions marquées par fluorescence de ces
anticorps pour étiqueter les micro-organismes et les isoler d'un
échantillon de salive en utilisant la cytométrie en flux.
Le
premier postdoctorant du projet, James Campbell, a utilisé cette
approche pour obtenir plusieurs cultures contenant des
Saccharibacteria. Mais ce n'est que des années plus tard,
après que Karissa Cross, étudiante diplômée, a repris le projet
en 2014, que l'équipe a réussi.
« C'était
tellement difficile, et il y avait de nombreux cas où je me sentais
comme si cela n'allait jamais se produire », se souvient
Cross, maintenant postdoctorant à l'Université Vanderbilt de
Nashville, au Tennessee. Elle a essayé la culture liquide, la
culture solide et la gélose au chocolat, à base de globules rouges
lysés, entre autres recettes. « Il a fallu des jours pour
créer des milieux. » Rien n'a marché.
Puis,
en 2015, d'autres
chercheurs ont signalé un indice crucial: les Saccharibacteria
ne peuvent pas vivre seules. Ces minuscules bactéries sphériques,
de seulement 200 à 300 nanomètres de diamètre, nécessitent un
hôte du phylum Actinobacteria. En essayant d’isoler les
Saccharibacteria, le groupe de Podar avait par inadvertance
omis un partenaire clé.
Enfin,
à l'été 2018, Cross a obtenu des séquences ADN correspondant aux
Saccharibacteria de l'une de ses co-cultures - et pas
seulement de n'importe quelle Saccharibacteria, mais
probablement d'une nouvelle
famille ou d'un nouvel ordre. Ce fut son moment eureka le plus
important de ses études supérieures, dit-elle. Elle a envoyé un
courriel à Podar, « Je pense que nous l'avons eu »,
et quelques secondes plus tard, elle a entendu ses pas descendre le
couloir. Ils ont topé leurs mains.
La
bonne recette
Quand
il s'agit de nourrir de tels microbes difficiles, les détails
comptent. Et un buffet à volonté d'acides aminés et de sucres,
tels que ceux que l'on trouve dans les formulations de milieux
standardisés, n'est pas nécessairement la bonne approche, explique
Jörg Overmann, microbiologiste et directeur scientifique du Leibniz
Institute DSMZ-German Culture Collection of Microorganisms and Cell
Cultures à Braunschweig. La baisse de la concentration en nutriments
retarde la croissance des microbes à croissance rapide, donnant aux
producteurs lents le temps de se répliquer.
Les
substrats de croissance physique sont également importants. L’équipe
d’Overmann fait parfois pendre un morceau de surface solide - de
l’acier ou du verre, par exemple - dans une culture liquide pour
fournir un substrat aux biofilms. « Nous obtenons des
produits entièrement nouveaux qui sont entièrement différents de
ce que vous obtenez sur une milieu gélosé », dit-il. Dans
une étude utilisant cette technique avec des échantillons d'eau
douce et de sol, l'équipe
a dénombré plus d'une douzaine de types de bactéries jamais
cultivées, dont au moins cinq nouveaux genres.
L'équipe
de Kamagata utilise des bioréacteurs pour maintenir un flux de
nutriments et éliminer les déchets. Garder la concentration globale
de nutriments à un niveau plus bas reflète mieux l'habitat marin
des organismes cibles, dit-il. Les
chercheurs et leurs collaborateurs ont suspendu une éponge en
polyuréthane (comme une éponge de cuisine) dans un réacteur pour
mettre en culture, pour la première fois, une archéon d'eau
profonde du clade de type eucaryote connu sous le nom d'Asgard
archaea.
Pour
savoir où commencer, les chercheurs peuvent consulter la base de
données BacDive, qui répertorie les caractéristiques et les
conditions de culture de plus de 80 000 souches cultivées provenant
de 34 phylums bactériens et 3 phyliques archéens. Les informations
génomiques, lorsqu'elles sont disponibles, peuvent également
fournir des indices, explique Christian Jogler, microbiologiste à
l'Université Friedrich Schiller d'Iéna, Allemagne.
Mais
même les préoccupations des piétons peuvent faire une différence,
prévient Jogler. Plutôt que de compter sur des systèmes de
purification d'eau ultra pure, tels que Milli-Q, que de nombreux
laboratoires utilisent, le groupe Jogler fabrique sa propre eau pure
en la distillant deux fois. L'eau Milli-Q peut contenir des produits
chimiques qui bloquent la croissance de certaines cultures, dit-il.
De plus, ajoute Jogler, la gélose couramment utilisée comme agent
gélifiant peut inhiber la croissance, il essaie donc parfois des
alternatives telles que la gomme
gellane.
Hub
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Même
la façon dont la gélose est préparée peut être importante, a
découvert le groupe de Kamagata. Lorsque la gélose est stérilisée
à la chaleur avec des phosphates, elle produit du peroxyde
d'hydrogène qui empêche certains microbes de se développer.
L'autoclavage des composants séparément élimine le problème et a
permis à l'équipe
de cultiver des microbes auparavant non cultivés.
La
patience est la clé. Il a fallu plus de 12 ans à Kamagata
et à ses collègues pour développer leur archéon, baptisé
provisoirement 'Prometheoarchaeum syntrophicum'. Mais une fois
que les microbiologistes obtiennent la première culture d'un nouvel
organisme, ce microbe se développe généralement plus rapidement.
Epstein
appelle le processus domestication. Il suggère qu'au cours du
premier cycle de croissance lent, certains microbes modifient leur
épigénome; les marqueurs moléculaires sur l'ADN qui contrôlent
l'expression des gènes, pour s'adapter aux conditions de
laboratoire. Ensuite, ils grandissent plus vite.
Terre
et ciel
Maintenant,
Epstein développe une technologie pour isoler et cultiver de
nouveaux microbes entièrement in situ.
Il
appelle le dispositif Gulliver, en l'honneur de l'aventurier dans le
livre de Jonathan Swift, 1726, les voyages de Gulliver. Les gullivers
sont de petites boîtes remplies de gel stérile, avec une surface à
membrane semi-perméable, comme celle de l'ichip, pour permettre aux
nutriments et aux signaux de se diffuser. Un seul pore, d'un
micromètre de diamètre, permet à un microbe individuel d'entrer de
l'environnement. Ce microbe devrait boucher l'entrée, mais ses
descendants pourraient peupler le gel à l'intérieur de la boîte,
formant une colonie.
Finalement,
dit Epstein, il pourrait être possible d'obtenir des résultats d'un
gulliver sans l'ouvrir, ni même le récupérer. Les nanocapteurs
pourraient collecter et renvoyer des données sur les niveaux
d'oxygène ou de dioxyde de carbone, ou sur la production de composés
de signalisation ou d'antibiotiques, imagine-t-il. Après avoir
laissé tomber l'appareil, disons, dans les profondeurs de l'océan
Arctique, les chercheurs pourraient simplement partir en vacances et
attendez que les résultats affluent, plaisante-t-il.
Dans
les mois à venir, Epstein prévoit de tester des gullivers au mont
Erebus, un volcan antarctique actif. Mais son objectif ultime est
au-delà de la Terre, déployant les appareils sur des corps
potentiellement hébergeurs de vie tels que Mars ou la lune de
Jupiter, Europe.
Le
temps dira si des microbes existent dans de tels endroits. En
attendant, il y a beaucoup de diversité microbienne sur la Terre
pour occuper les chercheurs. Avec les bonnes techniques, dit Raoult,
il devrait être possible de domestiquer et d'étudier tout
micro-organisme, à terme.
«Non
cultivable», estime-t-il, « est une insulte au futur. »
