Des phages rapporteurs génétiquement modifiés utilisés pour la détection et la différenciation rapide par bioluminescence de cellules viables de Listeria monocytogenes

Voici un article, disponible gratuitement en intégralité, paru dans Applied and Environmental Microbiology, une revue de l’ASM, à propos « Des phages rapporteurs génétiquement modifiés pour la détection et la différenciation rapide par bioluminescence de cellules viables de Listeria monocytogenes ».

Résumé

L'agent pathogène Listeria monocytogenes provoque la listériose, une maladie d'origine alimentaire grave associée à une mortalité élevée. Des méthodes rapides et sensibles sont nécessaires pour la détection spécifique de ce pathogène pendant la production alimentaire. Les bactériophages rapporteurs basés sur la bioluminescence sont des virus génétiquement modifiés qui infectent leurs cellules hôtes avec une spécificité élevée et intègrent un gène de luciférase hétérologue dont l'activité peut être détectée avec une sensibilité élevée pour indiquer la présence de cellules cibles viables.

Ici, nous utilisons la biologie synthétique pour l'assemblage et l'activation du génome de novo ainsi que l'ingénierie de phages assistée par CRISPR-Cas pour construire un ensemble de phages rapporteurs pour la détection et la différenciation des cellules viables de Listeria. Sur la base d'un squelette de phage unique, nous comparons les performances de quatre phages rapporteurs qui codent pour différentes luciférases de crustacés, de cnidaires et bactériennes. À partir de ce panel de protéines rapporteuses, la nanoluciférase (NLuc) a été identifiée comme une enzyme supérieure et a ensuite été introduite dans les génomes d'un phage à large spectre d'hôtes (A511) et de deux phages spécifiques de Listeria sérotype 1/2 et sérotype 4b/6a (respectivement, A006 et A500).

Le phage A511::nlucCPS à large spectre avec NLuc détecte une UFC de L. monocytogenes dans 25 g de lait, de charcuterie et de laitue contaminés artificiellement en moins de 24 h. De plus, ce phage rapporteur a réussi à détecter Listeria spp. dans des échantillons d'aliments naturels potentiellement contaminés sans produire de résultats faussement positifs ou faux négatifs. Enfin, A006::nluc et A500::nluc permettent le diagnostic de Listeria spécifiques selon le sérotype.

En conclusion, ces phages rapporteurs basés sur NLuc permettent une détection et une différenciation rapides et ultrasensibles des cellules viables de Listeria en utilisant un protocole simple qui est 72 h plus rapide que les approches dépendantes de la culture.

Importance

Les méthodes dépendantes de la culture sont la référence pour la détection sensible et spécifique des bactéries pathogènes dans la chaîne de production alimentaire.

Contrairement aux approches moléculaires, ces méthodes détectent les cellules viables, ce qui est un avantage clé pour les aliments générés à partir d'un matériau source inactivé par la chaleur. Cependant, les diagnostics basés sur la culture sont généralement beaucoup plus lents que les stratégies moléculaires ou protéomiques.

Les tests avec des phages rapporteurs combinent le meilleur des deux mondes et permettent une évaluation en ligne quasi-sûre de la sécurité sanitaire microbienne car la réplication des phages est extrêmement rapide, hautement spécifique à la cible et limitée aux cellules hôtes métaboliquement actives. De plus, les tests avec des phages rapporteur sont peu coûteux et ne nécessitent pas de personnel hautement qualifié, ce qui facilite leur mise en œuvre sur site.

Les phages rapporteurs présentés dans cette étude permettent non seulement une détection rapide mais également une estimation précoce de la virulence potentielle des isolats de Listeria provenant des sites de production et de transformation des aliments.

Les phages rapporteurs présentés dans cette étude permettent non seulement une détection rapide mais également une estimation précoce de la virulence potentielle des isolats de Listeria provenant des sites de production et de transformation des aliments.

Les phages rapporteurs présentés dans cette étude permettent non seulement une détection rapide mais également une estimation précoce de la virulence potentielle des isolats de Listeria provenant des sites de production et de transformation des aliments.